华民生物：PBMC分离及TRIzol裂解标准操作规程

摘要：本文系统阐述了华民生物从羊驼外周血中分离外周血单个核细胞 （PBMC） ，并采用TRIzol试剂进行细胞裂解及裂解液保存的完整实验流程。重点详述了洗涤后PBMC的PBS重悬分装、TRIzol裂解以及吹打匀浆至水样状态的关键操作要点，为同类实验提供了可重复的标准化操作参考。

一、实验背景

纳米抗体的发现与制备，核心依赖于从经免疫羊驼的外周血淋巴细胞中获取重链抗体可变区（VHH）基因序列。外周血单个核细胞（PBMC）是淋巴细胞与单核细胞的主要来源，其分离纯度、细胞活性以及后续提取的RNA完整性，直接决定了噬菌体展示文库的多样性与后续抗体筛选的成功率。TRIzol法凭借其高效的一步式细胞裂解与核酸保护能力，能够有效抑制内源性RNase活性，是目前实验室提取PBMC总RNA最常用的方法。因此，建立规范的PBMC分离、TRIzol裂解流程以及科学的样品冻存方法，是保障多批次实验结果一致性与稳定性的重要基础。

二、材料

2.1 主要试剂

EDTA抗凝采血管、PBS缓冲液（1×，pH=7.4不含钙镁）、人外周血淋巴细胞分离液、TRIzol试剂。

2.2 主要耗材与设备

水平离心机、超净工作台、微量移液器、2 mL螺口冻存管（RNase-Free）、无菌巴氏吸管、50 mL离心管。

2.3 实验动物

经免疫程序处理的目标羊驼，免疫方案依项目需求确定。

三、实验步骤

3.1 外周血采集

由专业实验员进行颈静脉穿刺，采用含EDTA的真空采血管收集外周血，常规采集量为50–100 mL。采血过程避免溶血，采后立即轻柔颠倒混匀8–10次以保证抗凝充分。采集后血样于室温（15–25°C）暂存，并在2小时内启动分离实验。

3.2 血液稀释

将EDTA抗凝血与等体积预温至室温的无菌PBS（1×）按1:1比例混合。缓慢颠倒混匀，至血液与PBS充分混合，黏度明显降低。稀释可有效减少红细胞聚集，优化后续密度梯度离心的分离效果。

3.3 密度梯度离心分离PBMC

向50 mL离心管底部加入15 mL人外周血淋巴细胞分离液，随后沿管壁缓慢叠加稀释血液25 mL，维持清晰液面分界。使用水平转头离心机，于20℃以2200 rpm离心25分钟，离心机的升速为1，降速为0（关闭刹车）。

离心后液体呈现清晰分层：

·最上层为血浆与血小板，呈淡黄色；

·中间白膜层（约1–2 mm厚）即为PBMC层，富含淋巴细胞与单核细胞；

·白膜层之下为透明的人外周血淋巴细胞分离液；

·管底为红细胞与粒细胞沉淀。

用无菌巴氏吸管小心吸取白膜层（10 mL血一般吸取5 mL白膜层），转移至新50 mL离心管，轻柔吹打至无明显的细胞团。

3.4 PBMC第一次洗涤

向收集的白膜层细胞悬液中加入PBS至总体积约45 mL，轻柔吹打混匀。于20℃以450 ×g离心15分钟，离心机的升速为9，降速为9。小心弃去上清，管底可见米白色PBMC沉淀和红色红细胞沉淀，少量的红细胞不会影响后续实验。

3.5 细胞分装与第二次洗涤

在超净工作台中进行分装，向第一次洗涤后的PBMC沉淀中加入少量PBS（根据5 mL的血加1 mL的PBS来计算加多少PBS），轻轻吹打使细胞均匀重悬。细胞悬液应呈均一浑浊状，无明显团块。将细胞悬液按每管1 mL分装至若干2 mL螺口冻存管（RNase-Free）中，进行第二次洗涤，离心条件：300 ×g，5 min，20℃；离心结束后，弃上清。

3.6 TRIzol裂解与吹打匀浆

将分装管中的细胞沉淀轻轻弹散，至细胞沉淀无明显结块，快速向每支分装管中加入1 mL TRIzol，随后立即反复吹打数次，使细胞与裂解液充分接触。加入TRIzol瞬间，溶液因细胞膜破裂及基因组DNA释放而变得高度黏稠，呈拉丝状。

继续使用微量移液器对每管混合液进行持续吹打混匀，黏稠度显著下降，溶液由难以吹打的胶状状态变为流动性良好的均一水样状液体，该转变是细胞裂解完全的核心指示。

3.7 静置与冻存

吹打匀浆完成后，将2 mL螺口冻存管于室温静置10分钟，使核蛋白复合物彻底解离。随后拧紧管盖，用封口膜密封，在管壁标记样品信息，立即放入-80°C冰箱保存。

四、关键注意事项

1.白膜层吸取：动作应轻柔准确，尽量减少分离液混入，以降低后续洗涤压力及血小板残留。

2.吹打匀浆判断：溶液从黏稠转为水样是必不可少的操作重点，吹打不充分导致RNA提取物中基因组污染升高，影响后续PCR特异性。

3.冻存前静置：静置10分钟是TRIzol裂解标准操作步骤，可保证核蛋白体充分解离，勿省略。

4.所有试剂及耗材均是无菌和 RNase-Free 的。

五、结语

本文详述了从羊驼外周血分离PBMC至TRIzol裂解液冻存的标准化流程，涵盖了采血、稀释、离心分离、洗涤、重悬分装、TRIzol裂解吹打及冻存等全步骤。其中，洗涤后少量PBS重悬分装与吹打至水样状是实现高效裂解和RNA高质量保护的关键环节。该流程作为羊驼纳米抗体发现的入口实验，为文库构建提供了稳定可靠的前端保障。