华民生物羊驼免疫服务交付标准

一、总则

1.1 适用范围

   本标准规定了华民生物（乙方）为合作客户（甲方）提供羊驼专项免疫服务的技术规范、质控体系、操作流程及交付标准，适用于所有类型免疫源羊驼免疫服务。服务包括免疫方案制定、免疫流程、血清效价监测、外周血单个核细胞（PBMC）分离，提供原始记录及报告。

1.2 服务定义

   羊驼免疫服务：由甲方提供免疫源，乙方提供羊驼，严格遵循标准化羊驼免疫流程，完成动物规范化免疫、阶段性血清抗体效价监测、达标后外周血采集与PBMC分离等全套操作。项目最终交付物为免疫阴性血清、各阶段免疫血清及达标PBMC样本，服务终止节点为所有合规样本及实验资料完整交付。

   核心服务范围包含：实验动物饲养、标准化免疫流程、阶段性抗体效价ELISA检测、PBMC分离与样本保存，全程配套完整质控与实验溯源记录。

二、实验动物质量标准

2.1 动物筛选标准

   实验选用羊驼（Alpaca），优选2–3岁龄青壮年健康个体。该年龄段羊驼免疫系统发育完全、免疫应答活性强、抗体多样性丰富，是纳米抗体制备免疫实验的最优个体。

2.2 健康质控要求

   所有免疫实验羊驼均源自合规标准化养殖基地，入选个体体征达标：免疫前设置不少于30天的预养观察期，采食、反刍、活动状态正常、精神状态活跃、毛色均匀光亮、体态体型标准、无外伤、无感染、无应激不适症状，严禁选用妊娠期雌性羊驼开展免疫实验，规避免疫应答异常及样本报废风险。

2.3 免疫前基线采血

  正式启动免疫程序前，统一采集羊驼外周全血5 mL，分离制备阴性对照血清，规范分装，-80℃保存。

三、核心实验与交付技术标准

3.1 标准化免疫程序

   本公司采用行业成熟的羊驼免疫方案，标准流程包含6次免疫，全程设置多节点效价监测，配套2次及以上PBMC采集制备服务。常规免疫周期为45–77天，相邻两次免疫间隔14天，保障机体充分产生体液免疫应答，积累高多样性抗原特异性B细胞。

   各免疫节点后7天开展血清效价检测，根据ELISA效价结果，双方共同确认是否启动PBMC采集与分离操作。完成6针标准免疫后，若抗体效价未达到合格阈值，可按需追加加强免疫，直至免疫应答达标。

   标准免疫周期执行方案如下：

表1 免疫周期表

3.2 PBMC分离制备与质控标准

   本项目采用标准化密度梯度离心法，从50 mL羊驼外周血中分离纯化外周血单核细胞（PBMC）。在标准采血量、规范实验操作前提下，单批次PBMC收获量稳定维持在1.6×10⁸ ~ 2.5×10⁸个，满足羊驼纳米抗体文库构建需求。

图1. 采集50 mL羊驼外周血

PBMC核心质控指标

1. RNA完整性质控（必检项）

   对PBMC样本进行琼脂糖凝胶电泳检测，样本需清晰显示28S、18S、5S三条特征rRNA条带，条带完整锐利（28S：18S约2:1）、明亮、无明显弥散、无降解拖尾，证明细胞总RNA完整性良好，可保障后续反转录、VHH基因扩增等分子实验。

图2. 总RNA琼脂糖凝胶电泳图（胶浓度为2%）

2. 细胞活性质控（可选检项）

   采用台盼蓝染色排除法检测细胞活力，显微镜下计数死活细胞比例。合格PBMC样本活细胞率≥90%，细胞状态饱满、活性稳定，无大量细胞凋亡、破碎情况。

图3.显微镜下（10×10）PBMC细胞及细胞活性观察

3.3 Trizol裂解型PBMC交付标准

   PBMC分离纯化完成后，立即加入10 mL Trizol裂解液充分混匀裂解，快速灭活细胞内核酸酶，最大程度保护总RNA完整性，裂解后样本标准化分装，单管分装1 mL，共计10管。

   所有分装样本即刻转入-80℃超低温冰箱避光密封保存，全程低温冷链管控。交付样本统一规范标注：羊驼唯一编号、样本类型、分离日期、批次信息、保存条件，确保样本全程可溯源。

图4.PBMC (in Trizol)样本分装

3.4 活PBMC样本交付标准（可选服务）

   若甲方需求为活体PBMC样本，我方严格执行梯度降温冻存标准：采用专用细胞冻存液，通过程序梯度降温仪完成标准化冻存，规避细胞冻伤、凋亡问题。交付活体PBMC样本存活率≥95%，细胞复苏后活性、功能状态良好，可直接用于后续单B细胞筛选。

图5.细胞梯度冷冻盒

四、实验记录与报告规范

      项目全程留存完整溯源实验数据，最终输出全套标准化实验报告，完整覆盖项目全流程操作、关键参数、检测结果及专业分析，确保实验可重复、数据可追溯。

4.1 免疫流程溯源记录

  详细存档每只实验羊驼唯一标识编号、全程免疫时间节点、抗原注射剂量、免疫给药途径、佐剂使用类型。同步记录每次免疫后羊驼的精神状态、采食情况、应激反应等健康观测数据，形成完整的动物免疫档案。

4.2 采血与血清分离记录

  完整记录免疫前基线采血、各次免疫后监测采血的时间、采血量、采血部位（羊驼颈部静脉标准采血）。所有血液样本统一室温静置、4000 rpm离心10 min分离血清，精准记录每批次血清分离体积、分装数量、保存条件，所有血清样本均-80℃超低温冷冻保存。

4.3 ELISA抗体效价检测报告

  全程记录ELISA检测完整参数：试剂配比、包被条件、孵育时间、仪器检测波长、校准参数。检测严格以甲方提供的特异性抗原为包被抗原，以同个体免疫前阴性血清为空白对照，按需设置阳性对照。报告完整留存各稀释度血清OD值、效价判定依据、最终抗体效价结果，数据真实原始、可复核。

图6.效价结果

4.4 PBMC分离决策与实验记录

  每次效价检测完成后，甲乙双方结合免疫应答数据共同判定是否启动PBMC制备。确定取样后，完整记录PBMC分离日期、实验羊驼编号、采血体积、分离关键实验参数、最终细胞收获总量、RNA完整性检测结果、细胞活力检测结果（如有），形成闭环实验记录。

五、最终交付物与交付规范

5.1 全套交付物清单

表2 交付物清单

5.2 交付运输方式

1. 血清样本：顺丰快递，冰袋运输。

2. PBMC裂解样本：顺丰快递，干冰运输。

3. 实验报告资料：电子版文件发送至甲方指定邮箱；如需纸质盖章原件，安排寄送。